0 0.5 Alla mia famiglia e alla mia ragazza che mi é stata vicina durante i miei studi.
to 0 Desidero ringraziare il prof. P. Civera e l'ing. D. Demarchi per la disponibilitá dimostrata nel corso della tesi, per i preziosi consigli forniti e per la pazienza che hanno avuto nei miei confronti. Un ulteriore ringrazimento va all'Ing. M. Ruo Roch, alla dottoressa D.Petroni ed ai miei colleghi del laboratorio VLSI
Una tappa fondamentale nel cammino delle scienze biologiche moderne é
rappresentata dalla scoperta della reazione a catena della Polimerasi (PCR).
Questo
processo permette di produrre, in numero illimitato, copie di segmenti di DNA
in modo sorprendentemente semplice.
La vasta applicazione della PCR e delle tecniche di
amplificazione nucleotidica ad essa connesse, si é tradotta
nello sviluppo di vari dispositivi in grado di realizzare i cicli
termici necessari a favorire questa reazione.
L'avvento dei micro-bio-chip ha avviato
un processo di fusione tra i domini della microelettronica e della biologia
molecolare, aprendo la via a nuove soluzioni tecnologiche per
l'indagine genetica.
Lo sfruttamento di queste nuove tecnologie
permette di ridurre le dimensioni degli strumenti di analisi e di renderne
automatico il funzionamento. Ciò si riflette nella diminuzione dei costi
del singolo esame diagnostico, in quanto la miniaturizzazione consente di
effettuare test paralleli: ciò riduce la quantità dei reagenti impiegati
e i relativi costi, mentre l'automazione ne semplifica l'esecuzione, evitando
la richiesta di personale specializzato riducendo gli errori
nelle manipolazioni.
Il lavoro svolto nella tesi si inserisce all'interno
di un progetto molto piú ampio, che si prefigge di realizzare
l'integrazione del processo di analisi del
DNA in ogni suo aspetto, cioé
Nel primo capitolo vengono focalizzati alcuni punti della biologia molecolare. In particolare viene descritta la struttura della molecola del DNA (acido desossiribonucleico) ed i suoi componenti base che sono i Nucleotidi, allo scopo di rendere piú chiaro il funzionamento della P.C.R. Si analizza in dettaglio la reazione a catena della Polimerasi ed alcuni aspetti che discostano il processo reale da quello ideale.
I vari dispositivi per la realizzazione della Polimerasi vengono brevemente descritti nel secondo capitolo, in particolare si riporta l'esperimento di Wilding con un particolare interesse verso le caratteristiche della microcamera di reazione utilizzata. Vengono studiate in modo dettagliato tutte le caratteristiche termiche che riguardano i moduli termoelettrici (la cifra di merito, il coefficente di performance) e le connessioni in cascata di celle per la realizzazione di salti termici superiori ai 70 gradi centigradi. In questa sezione si affronta il problema legato al controllo termico, indicando i principali passi svolti e motivando le scelte progettuali attuate. L'utilizzo dei dispositivi termoelettrici non rappresenta l'unica possibilitá nella progettazione di un thermal cycler ma, da un confronto con altre soluzioni realizzative, risulta il piú adatto.
La rilevazione della temperatura della microcamera e l'attuazione del controllo automatico viene affrontata nel terzo capitolo. Un sensore a semiconduttore viene posto nelle immediate vicinanze della microcamera ed il segnale fornito, dopo essere stato opportunamente scalato ed amplificato per ottenere in corrispondenza dell'intervallo di temperatura in ingresso
una tensione di uscita tra 
, viene utilizzato dal convertitore analogico/digitale interno al microprocessore utilizzato per il controllo del processo. Analogamente il segnale di controllo fornito dal convertitore digitale/analogico, viene opportunamente scalato e funge da comando per il circuito di potenza dei moduli termoelettrici.
La misura della risposta al gradino é stato un primo passo per la caratterizzazione del sistema rappresentato dalla cascata di due moduli termoelettrici.
Una particolare attenzione é stata data allo studio delle caratteristiche del microprocessore utilizzato nel controllo della temperatura. Nel capitolo quattro si mettono in evidenza i motivi principali che hanno portato alla scelta di questo particolare microprocessore (l' MC68HC11 della Motorola) e viene analizzato in dettaglio ogni suo singolo blocco costitutivo (la C.P.U., il convertitore A/D, il Main Timer System) allo scopo di utilizzare al meglio le risorse disponibili.
Avendo utilizzato un microprocessore nella catena del controllo, nel capitolo cinque viene analizzata l'equazione di un controllore P.I.D. nel continuo e discretizzata sostituendo il termine integrale con una sommatoria e il termine derivativo con una differenza; alcune elaborazioni matematiche hanno portato alla determinazione di una forma ricorsiva facilmente implementabile sul microprocessore. Non possedendo un modello sufficientemente accurato del sistema dal punto di vista controllistico, la regolazione dei parametri del P.I.D. é stata eseguita per via sperimentale sulla base del metodo di Zigler-Nichols. Un'analisi dettagliata del programma scritto in linguaggio Assembler residente nell'EEPROM interna del microprocessore chiude questo capitolo; é di particolare interesse la subroutine LOOP che rappresenta il cuore del programma in quanto fornisce il valore della variabile del controllo ad ogni periodo di campionamento.
Il capitolo sei tratta le caratteristiche dell'interfaccia con l'utente finale realizzata su un Personal Computer portatile connesso al thermal cycler attraverso l'interfaccia seriale RS232c. Essa permette di programmare fino a dieci cicli termici diversi necessari per la realizzazione della P.C.R. e visualizza l'andamento istantaneo della temperatura della microcamera sia in modo grafico che numerico.
In fine nell'ultimo capitolo vengono esposti i profili termici realizzati e le prove realmente realizzate nel laboratorio di microbiologia molecolare dell'Ospedale Infantile Regina Margherita di Torino al fine di realizzare una PCR parallelamente ad un sistema giá commercializzato della Perkin Elmer. Le conclusioni sul lavoro svolto e l'analisi dei risultati chiudono questo lavoro di tesi.