La realizzazione dei cicli di temperatura

Il lavoro svolto in questo ambito si inserisce all'interno di un progetto molto più ampio che si prefigge l'integrazione del processo di analisi del DNA in ogni suo aspetto, cioè:

- la preparazione dei campioni,

- la duplicazione delle regioni più interessanti del DNA,

- l'analisi degli oligonucleotidi prodotti,

- l'elaborazione dei risultati.

L'attenzione di questo lavoro è stata rivolta alla realizzazione di un sistema elettronico, programmabile attraverso un personal computer, per il controllo automatico della temperatura all'interno di microcamere realizzate su struttura integrata; esso, attraverso l'impostazione di alcuni parametri caratteristici, è in grado di realizzare i profili termici necessari per la realizzazione della reazione a catena della polimerasi.

Figure: Sistema completo formato dal Personal Computer portatile e dal thermal cycler

I requisiti principali richiesti al dispositivo sono:

- costo di realizzazione contenuto

- dimensioni ridotte

- velocità media di riscaldameto/raffreddamento: $1^{0}C/s$

- campo di temperatura: $(4.0 \div 99.9)^{0}C$

- precisione : $0.4^{0}C$ tra $(50 \div 100)^{0}C$

L'evoluzione termica è stata affidata a due moduli termoelettrici (celle Peltier) connessi in cascata (ottimo compromesso in termini di prestazioni, dimensioni e prezzo), montati su di un dissipatore termico in alluminio, raffreddato da una elettroventola.

Figure: Struttura della cascata di moduli termoelettrici del thermal cycler

Figure: Una clip per reazione in SITU

Al di sopra della cascata di due moduli termoelettrici viene posto un piccolo contenitore metallico (clip) che contiene un involucro in materiale inerte (vetro) perfettamente sigillato per evitare fenomeni di evaporazione dello stesso. Questo piccolo contenitore detto microcamera è capace di contenere il materiale biologico da trattare in quantità dell'ordine dei $\mu l$ ed è la sede dove avviene effettivamente la reazione a catena della Polimerasi.

La cella di reazione ottimale per l'utilizzo del thermal cycler dovrebbe essere tale da non avere gradienti termici eccessivi al suo interno; sono stati fatti degli esperimenti negli anni scorsi da alcuni studiosi, P.Wilding e L.J.Kricka dell'Università della Pennsylvania [5] e da M.A.Northrup dei laboratori Leavermore [6] con buoni risultati. Questi ricercatori hanno costruito, dopo numerosi test su materiali diversi, una microcamera per la reazione in un chip di 17x15mm di circa $80\mu m$ di profondità contenente volumi di circa $9\mu l$. Il materiale con le caratteristiche migliori che è stato utilizzato è il diossido di silicio con spessore di $2000\AA$; per evitare eccessivi gradienti termici dentro la microcamera è stato necessario coprirla con Nitruro di Silicio che ha dato risultati più soddisfacenti di una copertura in vetro, anche perchè quest'ultimo ha un coefficente termico diverso da quello del silicio.

Figure: Microcamera in diossido di silicio

Questi ricercatori sono riusciti a duplicare con efficenza catene contenenti un numero di basi oligonucleotidiche che va da 50 a circa 1600. I cicli termici necessari sono stati realizzati sia con resistenze a film poste direttamente sul Biochip che con celle Peltier poste all'esterno del dispositivo.

I reagenti della reazione PCR, circa $15\mu l$ (si è preparata una soluzione in eccesso per sicurezza), contenuti nella punta di una pipetta Eppendorf sono stati trasferiti sul biochip collocando la punta sopra uno dei fori (porta d'ingresso) e quindi applicando una leggera pressione negativa sull'altro foro (porta d'uscita).

Durante i cicli la porta d'ingresso e quella d'uscita del biochip sono state sigillate con un piccolo strato metallico posto sul bordo del chip.

Dopo aver completato tutti i cicli necessari, il biochip è stato svuotato applicando una pressione positiva che ha trasferito il contenuto della microcamera in un contenitore per microcentrifuga; il campione è stato sottoposto ad elettroforesi contemporaneamente ad un campione identico realizzato con un thermal cycler della Perkin-Elmer modello 9600.

La cella di reazione utilizzata è stata progettata per l'amplificazione in situ, consistente in una microcamera di reazione di circa $35\mu l$, sigillata al di sopra delle cellule.

Al fine di misurare con la massima precisione possibile la temperatura raggiunta dalla microcamera, si è posto al di sopra della piramide dei moduli termoelettrici, una sottile lamina in metallo (per avere una misura più uniforme possibile) alla quale è stato saldato il sensore di temperatura.

I moduli termoelettrici sono stati collegati, tramite un circuito di potenza, ad un microcontrollore Motorola MC68HC711E9 nel quale è stato implementato un algoritmo di controllo di tipo PID (Proporzionale-Integro-Derivativo).

Pur non essendo oggetto del presente lavoro, è bene evidenziare alcuni aspetti legati alla rivelazione dei prodotti della PCR; il progetto originale prevede infatti di alloggiare, in prossimità della camera di reazione, un fotodiodo necessario per valutare la bontà del processo di amplificazione. Infatti al termine dei cicli termici il sistema viene raffreddato fino a $4^{o}C$ circa. In queste condizioni l'entità del rumore termico è tale da non interferire, permettendo al fotodiodo di lavorare in condizioni ottimali. Per questo motivo, sin dall'inizio, è stata scartata la possibilità di realizzare il pilotaggio dei moduli termoelettrici (sebbene filtrando opportunamente il segnale sia possibile realizzare dispositivi non troppo rumorosi) modulando l'ampiezza di un'onda quadra (Pulse Width Modulation), in quanto una strategia di questo genere introdurrebbe nella catena di controllo una quantità di rumore rilevante. La diretta conseguenza di tutto ciò è stata quella di adottare un sistema di pilotaggio dalle caratteristiche continue che garantisse dal punto di vista del rumore.