Come accennato in precednza un filamento di DNA ha un'estremità chiamata, per convenzione chimica, 5' e l'altra estremità 3'; in una doppia elica di DNA, si dice che i filamenti complementari sono antiparalleli nel senso che l'estremità 5' di un filamento si appaia con l'estremità 3' dell'altro filamento e viceversa.
Nel 1955 Arthur Kornenberg e collaboratori della Stanford University scoprirono la DNA-polimerasi, un enzima che in natura assolve diverse funzioni, tra cui la riparazione e la duplicazione del DNA. La DNA-polimerasi può allungare un breve oligonucleotide che funge da primer(innesco) attaccando un ulteriore nucleotide all'estremità 3'; questo accade solamente se l'innesco è ibridato, o legato, con un filamento stampo complementare. La soluzione circostante deve anche contenere molecole di nucleotiditrifosfati (un nucleoside è formato da una base e da uno zucchero; un nucleoside fosforilato è un nucleotide) che fungono da unità costruttive.
Il nucleotide che la polimerasi attacca alla catena è complementare a quello che si trova nella posizione corrispondente sullo stampo: per esempio, se il nucleotide adiacente sullo stampo è l'Adenina, la polimerasi attacca la Timina; se il nucleotide dello stampo è la Guanina, la polimerasi attacca la Citosina. Ripetendo questa operazione, l'enzima riesce ad allungare l'estremità 3' dell'innesco fino a raggiungere l'estremità 5' dello stampo.
Le proprietà dell'enzima polimerasi sono utilizzate in un procedimento di laboratorio denominato sequenziamento didesossi, comunemente noto come tecnica di Sanger, dal nome di uno dei suoi scopritori, Frederick Sanger del British Medical Research Council Laboratory of molecolar Biology.
Per determinare le sequenze di DNA, la tecnica ricorre ad una DNA-polimerasi, a filamenti stampo, a inneschi, a nucleotiditrifosfati e a speciali didesossinucleotiditrifosfati (ddNTP). Come i normali nucleotidi, i ddNTP possono essere attaccati dalla polimerasi alle catene degli inneschi in via di allungamento, ma formano un cappuccio all'estremistà 3' che impedisce l'aggiunta di ulteriori nucleotidi.
La tecnica di Sanger produce inneschi allungati in varia misura e quindi incappucciati da un ddNTP; ordinando questi segmenti in funzione della lunghezza e sapendo quali ddNTP sono stati aggiunti, marcandoli magari con radioisotopi o molecole fluorescenti, un ricercatore può determinare la sequenza di basi nel filamento che funge da stampo. Per esempio, se in una determinata posizione viene aggiunta didesossiadenina (ddA), la base complementare corrispondente nello stampo deve essere T; l'aggiunta di didesossiguanina (ddG) sottintende la presenza di C nello stampo.