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Elettroforesi capillare (CE)

Per indicare questa tecnica vengono utilizzati diversi termini: elettroforesi capillare ad alta risoluzione (high performance capillary electrophoresis, HPCE), elettroforesi capillare zonale (capillary zonal electrophoresis, CZE), elettroforesi capillare in soluzione libera (free solution capillary electrophoresis, FSCE) e, infine, elettroforesi capillare (capillary electrophoresis, CE). Oggi uno dei termini più diffusi è CE. L'elettroforesi capillare può essere impiegata per separare una ampia gamma di composti biologici come aminoacidi, peptidi, proteine, ed acidi nucleici, così come qualsiasi altro tipo di composto organico di piccola dimensione.
L'elettroforesi capillare viene condotta in un tubo con un diametro interno solitamente pari a 50$\mu $m. Uno dei vantaggi derivanti dall'uso di tubi capillari è che vengono minimizzati i problemi derivanti dallo sviluppo di calore.

Figure 2.2: Schema di un apparato per elettroforesi capillare

Il diametro ridotto del capillare fa in modo che sia molto alto il rapporto tra la superficie e il volume del capillare e ciò aumenta considerevolmente la dissipazione del calore. Questo è di aiuto nell'eliminare sia i moti convettivi all'interno del capillare che la dispersione dei campioni per effetto della diffusione provocata dal calore. Non è quindi necessario includere all'interno del capillare un mezzo di supporto stabilizzante ed è così possibile fare l'elettroforesi in fase libera.
Alte efficienze di separazione sono ottenute utilizzando campi elettrici elevati; la lunghezza del capillare non influisce sull'efficienza del processo, ma essa gioca un ruolo importante nel tempo di migrazione e, quindi, sulla durata dell'analisi. La situazione ideale consisterebbe nell'applicare un potenziale il più alto possibile, utilizzando un capillare il più corto possibile. Tuttavia ci sono delle limitazioni pratiche. Quando la lunghezza del capillare diminuisce, la quantità di calore che deve essere dissipata aumenta in conseguenza della diminuzione della resistenza elettrica del capillare. Allo stesso tempo l'area di superficie disponibile per la dissipazione del calore diminuisce. Ad un certo punto, quindi, inizierebbero a farsi sentire gli effetti dovuti al calore e ciò pone un limite pratico all'utilizzo di capillari molto corti. Inoltre, più alto è il potenziale applicato, più alta diviene la corrente che attraversa il capillare e quindi, maggiore è la quantità di calore generata. In pratica si sceglie un compromesso tra il potenziale applicato e la lunghezza del capillare. Comunemente si utilizzano potenziali di 10-50kV con capillari di 50-100cm di lunghezza.
In figura 2.2 è riportato uno schema di un apparato per CE.
Il funzionamento è il seguente: una piccola quantità di soluzione contenente il campione (solitamente 5-30nl) viene introdotta dall'estremità anodica di un capillare in silice fusa contenente un tampone appropriato.

Figure 2.3: Tipico elettroforegramma: i picchi indicano il passagio dei prodotti di separazione, l'intensità indica il tipo di marcatore $\,$

Per la separazione viene applicato una differenza di potenziale tra le due estremità del capillare. Le molecole del campione cominciano quindi a migrare con velocità differenti lungo il capillare. La migrazione elettroforetica provoca il movimento delle molecole della soluzione con carica positiva verso l'elettrodo di carica opposta. Le molecole del campione con carica positiva, negativa o prive di carica migrano con differente velocità per effetto di questo flusso di tampone. Tuttavia, benché gli analiti siano separati in base alle diverse velocità di migrazione elettroforetica, essi vengono spinti verso il catodo per il fenomeno dell'elettroendoosmosi. Dal momento che questo flusso è piuttosto elevato, essendo la velocità del flusso elettroendosmotico molto più elevata della velocità di migrazione degli analiti, tutti gli ioni, indipendentemente dalla loro carica, si spostano verso il catodo. Le molecole con carica positiva raggiungono il catodo più velocemente perché la migrazione elettroforetica e il flusso elettroendoosmotico sono diretti verso la stessa direzione e, quindi, si sommano.
In vicinanza del catodo le molecole attraversano una finestra dove ne viene rivelato il passaggio attraverso varie tecniche.
Una separazione tipica dura da 10 a 30 minuti; in figura 5.12 è mostrato un tipico elettroferogramma ottenuto con l'elettroforesi capillare.
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Marco Delaurenti
1999-06-25